Методы лабораторного анализа качества продуктов переработки сои в комбикормовой промышленности

В конце 90-х годов соевый шрот производства США стал одним из основных источников растительного белка на кормовом рынке Российской Федерации.

Оказалось, что стандартных зоотехнических исследований недостаточно, чтобы оценить биологическую ценность данного продукта. Возникла необходимость расширения схемы анализов продуктов переработки сои за счет специальных методов.

В качестве специальных методов для оценки продуктов переработки сои используют:

1. Цветовое сравнение;

2. Скоростной цветовой тест с феноловым красным;

3. Тест с крезоловым красным;

4. Определение доступности лизина;

5. Определение активности уреазы;

6. Определение растворимых протеинов;

7. Определение индекса дисперсности протеина (PDI);

8. Определение активности ингибитора трипсина (TIA).

Цветовое сравнение – это эмпирический тест, который определяет степень термообработки сои с помощью специальной цветовой шкалы. Однако необходимо учитывать, что не только вид и степень тепловой обработки сои, но и происхождение сырья влияют на цвет и его интенсивность. Например, бразильские семена сои темнее американских.

Скоростной цветовой тест с феноловым красным основан на использовании раствора мочевины и индикатора фенолового красного. При контакте увлажненных бобов с таким раствором на них появляются маленькие красные пятна. По количеству и размеру пятен оценивают остаточную активность уреазы, которая линейно коррелирует с активностью ингибитора трипсина. На основе этой визуальной оценки можно говорить о степени термообработки сои.

Тест с крезоловым красным основан на том, что соевый белок окрашивается индикатором в красный цвет, а интенсивность окраски зависит от степени денатурации белка.

Все эти три метода являются очень приблизительными и могут служить подспорьем на производстве, перерабатывающем сою из постоянного и стабильного источника, а также проводящего исследования сои другими методами на регулярной основе в сторонних лабораториях.

Определение доступности лизина может проводиться как химическими, так и биологическими методами. Однако все эти методы скорее для научно-исследовательских центров, а не для лаборатории на производстве.

Определение активности уреазы является наиболее популярным и доступным методом анализа сои и продуктов ее переработки. Однако, проводя исследование данным методом, стоит помнить, что есть сорта сои с исходно низким содержанием уреазы. Содержание уреазы может меняться и в случае обработки семян сои или шрота органическими кислотами. Кроме того, при сравнении результатов, полученных из разных лабораторий, следует учитывать, что на конечный результат могут влиять следующие факторы:

1. Крупность помола образца (чем мельче помол, тем выше может быть активность уреазы – т.к экстракция проходит лучше);

2. Дискретность (количество знаков после запятой) рН-метра - точность снятия результата (если у прибора всего один знак после запятой на шкале, как померить, например, различия в 0,05 после инкубации образца?);

3. Точное соблюдение методики (обезжиривание, безусловное соблюдение временного интервала и температуры). Не все это помнят. Кроме того, некоторые забывают произвести пересчет на натуральное вещество после анализа обезжиренного образца.

Определение растворимых протеинов может проводиться различными методами, как по международным методикам, так и по российскому ГОСТу. В этом случае результаты для одного и того же образца, полученные разными методами, могут сильно отличаться. Причины этого можно рассмотреть на примере двух методов определения растворимых протеинов: ГОСТ 13979.3-68 и метод AJINOMOTO HEARTLAND LLC:

1. Размер частиц после размола. По обоим методам необходимо размалывать до прохода через сито с размером отверстий в 0,5 мм. Но в нашем ГОСТе есть пометка, что все, что не проходит через сито надо просто смешать с тем, что через сито прошло и использовать для дальнейшего анализа;

2. Размер навески (5 г по ГОСТ и 1,5 г по методике AJINOMOTO). Особого влияния такая разница в навесках оказывать не должна, но и «сбрасывать со счетов» это не стоит, т.к. чем больше навеска, тем репрезентативнее образец;

3. Объем раствора 0,2% щелочи (натриевая 200 по ГОСТ и калиевая 75 мл по методике AJINOMOTO). Если обратиться к п.2 (размер навески), то получается, что по ГОСТ на 1 г образца приходится 40 мл щелочи, а по методике AJINOMOTO – 50 мл щелочи. Если учесть, что в первом случае используется натриевая щелочь, а во втором – калиевая, то пропорция по гидроксильной группе в целом соблюдается;

4. Метод перемешивания (вручную по ГОСТ и магнитная мешалка по методике AJINOMOTO). Это наиболее критичный пункт, т.к. по ГОСТ мы просто перемешиваем каждые 15 минут вручную, но не указаны интенсивность и время перемешивания (можно колбу пару раз перемешать легким вращением, а можно 2-3 минуты интенсивно встряхивать). Это же касается и перемешивания на магнитной мешалке. Если магнит в колбе без «пояска» посередине – он будет перетирать образец и увеличивать растворимость. В методике не указана ни скорость вращения, ни размер магнита. Все это может сильно повлиять на конечный результат;

5. Время перемешивания (90 минут по ГОСТ и 20 минут по методике AJINOMOTO). Это тоже может влиять на конечный результат, т.к. сложно сравнить экстрагируемость (растворимость) за 90 минут при ручном перемешивании или за 20 минут на магнитной мешалке. Что лучше?

6. Фильтрование (по ГОСТ) и центрифугирование (по методике AJINOMOTO). Данный пункт не столь критичен, как предыдущие, но и здесь надо быть внимательным и не допускать переноса осадка в исследуемый образец. Часто исследователи комбинируют: сначала центрифугирование, потом фильтрование, для обеих методик;

7. Объем супернатанта на анализ (25 мл по ГОСТ и 15 мл по методике AJINOMOTO). Здесь объем тоже может сыграть злую шутку, т.к. по Къельдалю легче минерализовать 15, чем 25 мл (меньше пены, быстрее проходит выпаривание водной части, меньше потенциальных потерь при минерализации). Здесь следует отметить, что образец нужно отмерять только пипеткой Мора, но никак не цилиндром или стаканом. Это касается обоих методов;

8. Количество реагентов на «сжигание» (минерализацию) белка (5 мл кислоты по ГОСТ и 12,5 мл кислоты по методике AJINOMOTO, различное количество катализатора). В данном случае зарубежная методика однозначно лучше, т.к. минерализовать смесь 15 мл супернатанта и 12,5 мл концентрированной серной кислоты намного проще и быстрее, чем смесь 25 мл супернатанта и 5 мл кислоты. Да и катализатора по методике AJINOMOTO намного больше. Как практик могу посоветовать при использовании обеих методик процесс минерализации проводить в 15 мл концентрированной серной кислоты и 3,9 г комбинированного катализатора (сульфат меди и сульфат калия).

Мы с коллегами проводили сравнительный анализ соевого белкового концентрата обоими методами одновременно. Если учесть, что анализы проводились в одной лаборатории, в один день, на одном оборудовании и одним оператором, то различия между полученными результатами на 20% (абсолютных) не могут не настораживать. Это следует учитывать при сравнении результатов, полученных из разных лабораторий.

Определение индекса дисперсности протеина (PDI) может проводиться двумя методами:

1. Так называемый «медленный» метод определения Индекса Растворимости

Азота (или NSI). Метод проводится в соответствии с AOCS Official Method Ba 11-65, а полученный результат потом пересчитывается в Индекс Дисперсности Протеина (PDI) по формуле: PDI = 1,07 x NSI + 1. Здесь очень важно точно соблюдать методику, в т.ч.:

1.1. Размер частиц после размола;

1.2. Температуру и время инкубации – только водяная баня при 30ºС на 2 часа;

1.3. Использовать только «верхнюю» механическую лопастную мешалку с цифровой шкалой скорости вращения (ни в коем случае не магнитную мешалку);

1.4. Соблюдать скорость вращения строго 120 оборотов в минуту;

1.5. Использовать на мешалке «пропеллер» с указанными размером и углом наклона лопастей.

Любое отклонение от методики или «нововведения» могут привести к искажению результатов. Метод достаточно прост и имеет хорошую воспроизводимость и сходимость с классическим методом PDI.

2. Классический или «быстрый» метод определения Индекса Дисперсности Протеина (PDI) проводится в соответствии с AOCS Official Method Ba 10-65 или Ba 10a-05 (более старая версия). Здесь тоже есть «подводные камни» при проведении испытаний и оценке полученных результатов. Необходимо обратить внимание на следующее:

2.1. Желательно использовать указанный в методике «верхний» блендер Hamilton Beach Commercial (Model G936), т.к. в нем мотор расположен наверху, и раствор в стакане блендера от мотора не нагревается, что является очень важным моментом;

2.2. Если используют лабораторный или бытовой «нижний» блендер (мотор расположен под стаканом), то между экстракциями его следует охлаждать, т.к. после двух-трех экстракций горячий мотор нагреет раствор в стакане для экстракции, что приведет к завышению результатов;

2.3. Необходимо контролировать температуру в стакане блендера и не допускать ее повышения выше указанной в методике;

2.4. Нужно строго контролировать время (10 минут) по таймеру и скорость вращения вала блендера (8500 оборотов в минуту) с помощью стробоскопического или лазерного тахометра и регулировать ее при помощи ЛАТРа (лабораторного автортансформатора).

Данный метод сложнее, чем метод NSI, но намного быстрее.

Определение активности ингибитора трипсина (TIA) можно проводить двумя официальными методами: AOCS Official Method Ba 12-75 и ISO 14092. В первом всего две страницы - краткое описание метода. Во втором – 18 страниц и подробно прописано все необходимое, в т.ч. и методы контроля используемых растворов реактивов. Эти методы имеют серьезные отличия, которые могут отразиться на конечных результатах. Следует обратить внимание на следующие важные моменты:

1. По методу AOCS размер частиц образца после размола должен быть 100 меш (0,15 мм), а по методу ISO 14092 - 30 меш (0,5 мм). Т.е. разница более, чем в три раза;

2. По методу AOCS инкубация проводится 3 часа при комнатной температуре, а по методу ISO 14092 - 15-24 часов в холодильнике при +4ºС;

3. Для обоих методов необходимо строго соблюдать температурные режимы (водяная баня с дискретностью 0,1ºС и точностью ± 0,5ºС);

4. Соблюдение временных интервалов также очень важно, причем до 1 секунды. Отклонение в обе стороны не желательно, т.к. отразится на конечном результате;

5. Режим центрифугирования необходимо пересчитать из g (RCF – «относительная центробежная сила» или ОЦУ - «относительное центробежное ускорение»), указанного в методике в обороты в минуту (RPM), с учетом радиуса ротора для используемой в анализе центрифуги;

6. Важно происхождение и активность фермента. Если в ISO 14092 четко прописан метод контроля активности используемого трипсина, то в AOCS Official Method Ba 12-75 данный вопрос практически не раскрыт;

7. И завершающий и очень значимый этап – спектрофотометрическое измерение. Надо помнить, что окраска измеряемого раствора стабильна не более 2-х часов. Для измерения желательно использовать двулучевой спектрофотометр и кюветы с длинной оптического пути в 10 мм. Использование ридера для стрипов (по методу ИФА) может привести к большим погрешностям, т.к. толщина слоя раствора всего 1-2 мм.

Метод определения активности трипсина является наиболее точным и информативным для контроля качества и биологической ценности продуктов переработки сои. С другой стороны, он является наиболее сложным в выполнении из рассмотренных выше, и предъявляет высокие требования как к квалификации химика – исполнителя так и к оснащению лаборатории в целом.